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NGS測序技術服務 DRIP-seq |
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基因芯片技術服務 Small RNA修飾芯片 m6A單堿基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表觀轉錄組芯片 circRNA表觀轉錄組芯片 |
NGS測序技術服務 RNA m6A甲基化測序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA堿基修飾檢測 tRNA堿基修飾檢測 |
PCR技術服務 MeRIP-PCR技術服務 m6A絕對定量RT-PCR技術服務 m6A單堿基位點PCR（MazF酶切法）技術服務 |
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基因芯片技術服務 DNA甲基化芯片 DNA羥甲基化芯片 ChIP-chip |
NGS測序技術服務 DNA甲?；奏?5fc)修飾測序 DNA 5hmC 測序（化學法） DNA甲基化測序 DNA羥甲基化測序 染色質免疫共沉淀測序 |
PCR技術服務 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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蛋白相對定量 TMT標記定量技術 非標定量技術 |
蛋白修飾 TMT標記定量磷酸化 非標定量磷酸化 |
RNA/蛋白-蛋白相互作用 RNA-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
實時熒光定量PCR技術是在普通PCR反應體系中加入熒光試劑，利用熒光信號實時檢測PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一、靈敏、快速、高重復性地精確定量起始模板濃度。tRF & tiRNA是由tRNA切割產生，長度約15-45個核苷酸的小RNA。由于tRF & tiRNA長度太短，且與tRNA序列完全重疊，不能通過傳統的實時定量PCR進行檢測。本公司通過在tRF & tiRNA兩端引入人工合成序列（adaptor），設計特殊的跨連接位點的定量PCR引物，可以精確檢測微量樣品中tRF & tiRNA表達水平。
Aksomics（原康成生物）為您提供tRF&tiRNA 實時定量PCR技術服務，您只需提供保存完好的組織或者細胞標本，本公司專業的技術服務人員就可替您完成tRF&tiRNA實時定量PCR實驗操作和數據分析，提供給您完整的實驗報告，為您節省大量的時間和精力。
圖1. 雙端接頭法保證了tRF & tiRNA PCR產物的高特異性。
1. 引物設計、合成
設計并合成目的tRF & tiRNA的特異性PCR引物。
2. 樣品RNA抽提
a. 若實驗對象為組織樣品，取適量（50-100mg）新鮮組織樣品或正確保存的組織樣品，加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），勻漿后抽提RNA。
b. 若實驗對象為細胞樣品，每份樣品取1×106～1×107細胞，完全吸去培養液后加1ml的RNA抽提試劑Trizol（Invitrogen），裂解后抽提RNA。
3. RNA質量檢測
a. 紫外吸收測定法測定RNA在波長260nm和280nm的吸收值，獲得RNA的濃度并通過A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。
b. 甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。
注：用于tRF & tiRNA實時定量PCR檢測的RNA樣品，必須高純度、完整，沒有RNase 污染（降解的樣品不能用于實時定量PCR檢測），同時提取方法必須保證所得樣品包含完整的小RNA部分。
4.RNA預處理（可選）
使用rtStar? tRF&tiRNA Pretreatment Kit (Cat# AS-FS-005, Arraystar)進行預處理，去除3’氨?；┒伺c3‘環磷酸末端，磷酸化5’羥基末端，并移去m1A, m3C等多種甲基化修飾。
注：tRNA上存在大量的轉錄后修飾，而且tRNA需與氨基酸形成氨?；鵷RNA方可參與蛋白翻譯。當tRNAs被切割為tRFs&tiRNAs時，這些修飾（包括甲基化修飾、氨?；┒诵揎棧炕虿糠值谋Ａ粝聛?。tiRNAs常由RNA內切酶Angiogenin切割產生，這類內切酶會在切割位點產生5‘羥基（5’-OH）末端與3’環磷酸（3‘-cP）末端。然而，5’端與3‘端的接頭連接步驟，需要底物小RNA 5’ 端為磷酸，3‘端為羥基。此外，某些tRFs&tiRNAs的內部修飾比如m1A, m1G與m3C會嚴重阻礙反轉錄過程。因此為了準確檢測tRFs&tiRNAs，這些修飾必須被有效的去除。
5. 逆轉錄合成cDNA
使用rtStar? First-Strand cDNA Synthesis Kit (3’ and 5’ adaptor) (Cat# AS-FS-003, Arraystar) 試劑盒進行接頭連接和反轉,合成cDNA第一鏈。
6. 實時定量PCR
以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增，梯度稀釋的標準同時進行實時定量PCR擴增，根據Ct值制備標準曲線。以同樣的方法測定每個樣品中的內參，校正上樣誤差。
7. 分析結果、提供實驗報告
分析實時定量PCR結果，根據標準曲線定量樣品中的目的tRF & tiRNA。提供實驗報告，包括詳細的實驗方法，實時定量PCR實驗數據和圖表。
