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NGS測序技術服務 DRIP-seq |
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基因芯片技術服務 Small RNA修飾芯片 m6A單堿基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表觀轉錄組芯片 circRNA表觀轉錄組芯片 |
NGS測序技術服務 RNA m6A甲基化測序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA堿基修飾檢測 tRNA堿基修飾檢測 |
PCR技術服務 MeRIP-PCR技術服務 m6A絕對定量RT-PCR技術服務 m6A單堿基位點PCR（MazF酶切法）技術服務 |
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基因芯片技術服務 DNA甲基化芯片 DNA羥甲基化芯片 ChIP-chip |
NGS測序技術服務 DNA甲?；奏?5fc)修飾測序 DNA 5hmC 測序（化學法） DNA甲基化測序 DNA羥甲基化測序 染色質免疫共沉淀測序 |
PCR技術服務 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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蛋白相對定量 TMT標記定量技術 非標定量技術 |
蛋白修飾 TMT標記定量磷酸化 非標定量磷酸化 |
RNA/蛋白-蛋白相互作用 RNA-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
相關服務
Small RNA修飾芯片相關產品
相關資源
Arraystar Small RNA 芯片利用直接末端標記和和巧妙的探針設計，在同一芯片上同時定性及定量檢測多種small RNA，包括miRNA、pre-miRNA、tsRNAs、tRNAs和snoRNAs，為Small RNA的調控研究和生物標志物研究提供了重要的表達信息。
芯片特點
? 同時分析了主要的small RNA類別：miRNA、pre-miRNA、tRNA、tsRNA和snoRNA。
? 提高Small RNA表達譜的門檻，達到高靈敏度、特異性和準確性。
? 實驗流程簡單直接，克服了small RNA-seq中由于RNA修飾、RNA二級結構、反轉錄阻礙、PCR擴增和數據分析不準確造成的偏差。
? 所需的RNA樣本量低至100ng，為許多研究創造了機會。
? 可以檢測低質量RNA樣本，如降解的RNA、血清/血漿等體液RNA、FFPE RNA。
Arraystar Small RNA芯片列表
| 服務名稱 | 描述 | 規格 |
|---|---|---|
| Arraystar Human Small RNA 芯片 | miRNAs, pre-miRNAs, tsRNAs, tRNAs和snoRNAs | 8 x 15K |
| Arraystar Mouse Small RNA 芯片 | miRNAs, pre-miRNAs, tsRNAs, tRNAs 和snoRNAs | 8 x 15K |
? 同時篩選主要的small RNA類型
Arraystar Small RNA Array 包含miRNA、pre-miRNA、tsRNAs、tRNAs和snoRNAs。這些small RNA因其重要的基因調控功能和生物標志物潛力而對生物學和臨床科學具有特別的意義。通過small RNA-seq篩選這些small RNAs需要單獨的化學方法來構建測序文庫和分析，以覆蓋具有不同生化特性的small RNA。例如，miRNA-seq和tRNA-seq不能一起建庫來分析miRNA和tRNA?，F在Arraystar Small RNA Array 可以在同一實驗同一芯片上檢測這些small RNAs。
? 提高小RNA表達檢測的標準，達到高靈敏度、特異性和準確性
Arraystar Small RNA Array 使用高親和力的探針雜交，即使對低豐度的small RNAs也具有非常高的靈敏度。巧妙的探針設計采用了5’-發夾結構和標準化的序列靶標區域，以特異性的區分只有1~2核苷酸差異的small RNAs。
? 簡單直接的步驟確保了比small RNA-seq甚至qPCR有更好的無偏差定量
RNA修飾、RNA二級結構和復雜的RNA-seq建庫過程使得Small RNA-seq長期存在挑戰。在Arraystar Small RNA芯片中，Small RNAs在其3’-OH端直接與Cy3染料連接，完全避免RNA預處理去除內部RNA修飾，由于RNA修飾和RNA二級結構導致的逆轉錄失敗，以及有偏倚的PCR擴增步驟的影響。所有這些都有助于保持Small RNA水平的保真度，并實現比RNA-seq甚至qPCR更好的無偏的高定量精度。
? RNA樣本量要求較低
Arraystar Small RNA Microarray 只需100ng的總RNA，比Small RNA-seq所需樣本量要低。芯片由于直接進行RNA末端標記，沒有RNA預處理導致的RNA損失，顯著減少RNA總量需求，特別是對高度修飾的Small RNA(如tRNA和tsRNA)。Arraystar Small RNA Microarray對樣本量需求低，為樣本量少的研究提供了機會。
? 質量較低的RNA樣本也能檢測
Arraystar small RNA芯片的RNA直接末端標記對底物RNA序列中的核苷酸損傷相對不敏感，因為它不依賴于逆轉錄cDNA復制。這與Small RNA-seq形成鮮明對比，Small seq容易受到Small RNA序列的任何核苷酸損傷的影響。此外，雖然芯片探針不受不相關序列存在的影響，但降解RNA樣本中豐富的rRNA片段可以污染相似大小的Small RNA，抑制Small RNA-seq中的Small RNA檢出。
由于這些原因，Small RNA芯片對于長期保存或化學處理的樣品、降解的樣品特別有利。例如，血清/血漿等體液RNA/FFPE RNA。
小RNA定量檢測的挑戰和解決方案
Small RNA-seq 已被用于分析 microRNA 和其他小 RNA。 然而，利用small RNA-seq 測序數據來量化的小 RNA 的相對豐度與 qPCR/Northern Blot 結果不一致。 例如，通過small RNA-seq 測得的 miR-143 的水平比 miR-145 高 40 倍，但通過 qPCR 或 Northern Blot 測得它們的表達水平相當 [1-3]。 small RNA-seq 的不準確性主要是由于 small RNA-seq 文庫制備和數據分析過程的偏差對結果造成的誤導[4, 5]，在某些情況下，與真實豐度的偏差可高達 10,000 倍[6-11]。
SmallRNA定量檢測的挑戰
RNA修飾的干擾
在測序文庫構建和小RNA定量過程中，小RNA內部的修飾會嚴重干擾cDNA合成。 小RNA修飾（例如 m1A、m3C 和 m1G）會阻礙反轉錄并中止cDNA復制，導致序列偏向于啟動端，最終導致構建無偏倚全長序列文庫失敗。 例如，由于tsRNA TΨC 環區域中存在m1A修飾的阻礙，small RNA-seq通常識別 18nt 3'tsRNA，但遺漏了由Northern Blot檢測到的更主要的22nt tsRNA異構體。
文庫擴增的偏差
為了產生足夠的 cDNA 量進入測序儀，small RNA-seq需要對文庫進行PCR擴增 [12]。 然而，RNA G/C 含量、序列組成、二級結構、RNA 長度、啟動以及反應條件會導致 PCR 產物的偏差和扭曲。 也就是說，當轉錄組中的不同模板在PCR反應中一起擴增時，模板的偏好或阻滯擴增總是會導致 RNA 無法呈現真實的豐度 [13]。 因此，需要多輪 PCR 擴增的small RNA-seq定量從來都不是絕對定量，需要使用正交方法進行驗證。
圖 1. cDNA構建所涉及步驟的圖示，包括潛在的偏差來源。 (A) 具有不同5’端和3’端修飾的非蛋白質編碼RNA的起始池，由不同的線型示意性表示。 (B) 左圖描述了在RNA 5’端連接之前的不同酶預處理，以富集不同的RNA亞型。在各自的5’端預處理后可用于接頭連接的RNA類別在每個預處理下示意性表示。右圖描述了可用于3’端（-oligo(A)或-oligo(C)尾）和接頭連接的RNA類別的亞型。 (C)與RNA 5’（左）和3’（右）末端修飾以及cDNA構建的后續步驟相關的可能偏差。
采用TPM衡量small RNA表達水平的潛在問題
TPM(Reads Per Million reads)值通常是small RNA-seq用于表示小 RNA 轉錄本的相對豐度的指標，簡單地用測到的每百萬小RNA片段做歸一化。 然而，在這 100 萬次讀取中，一個小RNA的讀取計數的變化將改變所有其他RNA的TPM值，即使它們實際的絕對表達水平沒有改變。
所需樣品數量
對于tRNA和tsRNA測序，在文庫構建之前，目標RNA的分離和預處理需要 5-100ug[14] 的總RNA，這排除了樣本量有限的研究項目。
Small RNA篩選的解決方案
為了克服這些挑戰，Arraystar設計了Arraystar Small RNA Array 作為一種實用且有效的解決方案，以高靈敏度和準確度分析全譜small RNA，但需要的總RNA量要少得多。 Arraystar small RNA Array 結合直接末端標記和巧妙的探針設計微陣列技術，在一張芯片上同時檢測和量化包括miRNA、pre-miRNA、tsRNA、tRNA和snoRNA在內的小RNA（圖 1），為研究小RNA的調控功能和生物標志物潛力提供重要的表達信息。
圖 1. Arraystar Small RNA芯片的實驗流程?？俁NA用T4多核苷酸激酶 (T4 PNK) 去磷酸化，去除小RNA 3'端的磷酸(P)或環磷酸(cP)基團，形成3-OH末端。 然后3-OH末端的小RNA用DMSO打開二級結構并酶促連接Cy3標記。標記的RNA雜交到 Arraystar small RNA 芯片上，用于分析小RNA的表達。
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Arraystar Small RNA 芯片實驗流程
用T4多核苷酸激酶(T4 PNK)處理總RNA，去除3‘端殘留的磷酸鹽(P)和環磷酸鹽(cP)基團，以暴露3-OH。3-OH末端的Small RNA被DMSO變性，并通過連接用Cy3酶標記。將標記的RNA與Arraystar small RNA表達芯片雜交，以分析small RNA表達譜情況。
Arraystar Human small RNA 芯片 V1.0
| 探針總數 | 14,707 |
|---|---|
| 探針設計策略 | 整個探針由5’cap區， small RNA特異性區和3’linker區組成。 |
| 探針結合位點 |
5-p-miRNA 和 5'tsRNA: small RNA的3’區域 3-p-miRNA 和 3'tsRNA: small RNA的5’區域 Pre-miRNA: pre-miRNA的loop設計 tRNA: 成熟tRNA的反密碼子環序列 snoRNA: snoRNA全長中的特異性序列 |
| 探針特異性 | small RNA特異性 |
| miRNA數目 | 2,627 (1,318個5-p-miRNAs, 1,309個3-p-miRNAs) |
| pre-miRNAs數目 | 1,745 |
| tsRNAs數目 | 4254 |
| mature-tRNAs數目 | 346 |
| snoRNAs數目 | 955 |
| Small RNA來源數據庫 |
miRNA: miRBase (v22) pre-miRNA: miRBase (v22) tsRNA: tRFdb, MINTbase, GtRNADb (更新至 18.1 2019.08) tRNA: GtRNADb(更新至 18.1 2019.08), ENSEMBL(v99) snoRNA: ENSEMBL(v99) 文獻: 公開發表的文獻至 2019 (references 1-40)
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| 芯片規格 | 8 x 15K |
Arraystar Mouse small RNA 芯片 V1.0
| 探針總數 | 14,192 |
|---|---|
| 探針設計策略 | 整個探針由5’cap區， small RNA特異性區和3’linker區組成。 |
| 探針結合位點 |
5-p-miRNA 和 5'tsRNA: small RNA的3’區域 3-p-miRNA 和 3'tsRNA: small RNA的5’區域 Pre-miRNA: pre-miRNA的loop環設計 tRNA: 成熟tRNA的反密碼子環序列 snoRNA: snoRNA全長中的特異性序列 |
| 探針特異性 | small RNA特異性 |
| miRNA數目 | 1949 (966個5-p-miRNAs, 983個3-p-miRNAs) |
| pre-miRNAs數目 | 1,122 |
| tsRNAs數目 | 1,767 |
| mature-tRNAs數目 | 270 |
| snoRNAs數目 |
1,324 |
| Small RNA來源數據庫 |
miRNA: miRBase (v22) pre-miRNA: miRBase (v22) tsRNA: tRFdb, GtRNADb (更新至18.1 2019.08) tRNA: GtRNAdb(更新至to 18.1 2019.08), ENSEMBL(v99) snoRNA: ENSEMBL(v99) 文獻: 公開發表的文獻至 2019 [1-40] |
| 芯片規格 | 8 x 15K |
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數據分析結果包括檢測指標的熒光信號值、統計學分析、注釋信息和可供發表的高質量圖表。
差異表達的small RNAs
Mature-ID: 成熟的miRNA在miRBase ID .
FC: 兩組比較的差異倍數.
P-value: t-test的p值.
q-value (FDR): p-value的校正值(FDR）.
Mature-Sequence: 成熟miRNA的序列.
Seed: 成熟miRNA的種子序列. (成熟miRNA的2-8位堿基).
High_Confidence: miRNA有強有力證據支持作為一個經典的miRNA基因.
Type: MirGeneDB基于表達水平注釋miRNA類型.
tsRNA_type: tsRNA type (tRF-5, tRF-3, tRF-1, 5-Leader, 5-tiRNA, 3-tiRNA和i-tRF).
tsRNA-sequence: tsRNA的序列.
tsRNA-length: tsRNA的長度.
tsRNA-precursor: pre-tsRNA的基因名.
Level: tsRNA的可信水平
Functional - 具有特定的生物學功能或疾病關聯的記錄；
Reliable - 在tRFdb中記錄或有文獻報道，但未作進一步研究；
Potential - 由Arraystar根據RNA片段長度和tRNA中的切割位置進行預測。
Mechanism: tsRNA的分子機制.
Precursor-Sequence: pre-miRNA序列.
GenomeLocus: miRNA gene在基因組上的定位.
Promoter: miRNA 基因在Fantom5的啟動子名字.
pri-miRNA: 在Fantom5數據庫中miRNA初級轉錄本(僅適用于人類和小鼠).
pre-miRNA-cluster: 一組在同一染色體和DNA鏈上的mirna間距離<10kb的pre-miRNA。
Mature-ID: 該pre-miRNA產生的mature miRNA(不是star miRNA)的ID.
Sequence: tRNA isodecoder的序列.
Gene name: isodecoder tRNA的基因名.
GenomeLocus: tRNA isodecoder在基因組上的定位.
tRNA promoter Locus: tRNA isodecoder 啟動子在基因組上的定位.
tRNA promoter – 包括一個tRNA的基因加上 100bp的序列 (PMC6108506).
pre-tRNA locus:precursor tRNA isodecoder在基因組上的定位. .
pre-tRNA - precursor tRNA 其中包括一個tRNA基因加上100個堿基對上游序列和一個3’leader
tRNA neighboring gene: tRNA isodecoder最鄰近基因名.
snoRNA-sequence: snoRNA的序列.
Length: snoRNA長度.
Gene name: snoRNA的基因名.
snoDB_symbol: snoRNA 在snoDB數據庫的基因名 (http://scottgroup.med.usherbrooke.ca/snoDB/).
Box type: 基于高度保守基序的snoRNA盒類型(H/ACA和C/D).
Host gene id:內含子序列與snoRNA重疊的基因ID。
Host gene symbol: snoRNA宿主基因的基因名
Target count: snoRNA靶標數目
Target summary: snoRNA 靶標類型(lncrna, mirna, ncrna, protein coding, pseudogene, rrna, snorna, snrna, trna 和其他).
差異表達Small RNAs的層次聚類熱圖
圖1。差異表達miRNA的層次聚類熱圖。miRNA的表達水平用左上角顏色鍵中引用的紅藍色標度表示。頂部的樹狀圖顯示了樣本之間表達譜的相對接近度。樣本分組情況由熱圖上方的顏色條表示。
