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NGS測序技術服務 DRIP-seq |
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基因芯片技術服務 Small RNA修飾芯片 m6A單堿基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表觀轉錄組芯片 circRNA表觀轉錄組芯片 |
NGS測序技術服務 RNA m6A甲基化測序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA堿基修飾檢測 tRNA堿基修飾檢測 |
PCR技術服務 MeRIP-PCR技術服務 m6A絕對定量RT-PCR技術服務 m6A單堿基位點PCR（MazF酶切法）技術服務 |
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基因芯片技術服務 DNA甲基化芯片 DNA羥甲基化芯片 ChIP-chip |
NGS測序技術服務 DNA甲?；奏?5fc)修飾測序 DNA 5hmC 測序（化學法） DNA甲基化測序 DNA羥甲基化測序 染色質免疫共沉淀測序 |
PCR技術服務 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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蛋白相對定量 TMT標記定量技術 非標定量技術 |
蛋白修飾 TMT標記定量磷酸化 非標定量磷酸化 |
RNA/蛋白-蛋白相互作用 RNA-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
實時熒光定量PCR技術是在普通PCR反應體系中加入熒光試劑，利用熒光信號實時檢測PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法。實時熒光定量PCR能夠專一、靈敏、快速、高重復性地精確定量起始模板濃度。成熟microRNA是由21-25個核苷酸組成的小RNA，由于長度太短，不能通過傳統的實時定量PCR進行檢測。本公司通過特殊設計的莖環結構的反轉錄引物，配合實時定量PCR引物及探針可以精確檢測微量樣品中microRNA表達水平，也可以用終點PCR法定性檢測。
Aksomics（原康成生物）為您提供microRNA實時定量PCR技術服務，您只需要提供保存完好的組織或細胞標本，本公司專業的技術服務人員就可替您完成microRNA實時定量PCR實驗操作和數據分析，提供給您完整的實驗報告，為您節省大量的時間和精力。
1. 引物設計、合成
設計并合成目的microRNA的莖環RT引物、PCR引物和檢測用熒光探針，并合成該microRNA相應的DNA寡核苷酸作為標準。
2. 樣品RNA抽提
a．組織樣品：取適量（50～100mg）新鮮組織或正確保存的組織樣品，勻漿后用PURELINKTM試劑抽提RNA。
b．細胞樣品：取1×106～1×107細胞，PBS清洗細胞，吸去PBS后用PURELINKTM試劑抽提RNA。
3. RNA質量檢測
a．紫外吸收測定法測定RNA在波長260nm和280nm的吸收值，獲得RNA的濃度并通過A260/280及A260/230的吸收比值判斷RNA的純度。
b．甲醛變性瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA純度和完整性。
注：用于microRNA實時定量PCR檢測的RNA樣品，必須高純度、完整，沒有RNase污染（降解的樣品不能用于實時定量PCR檢測），同時提取方法必須保證所得樣品包含完整的小RNA部分。
4. 逆轉錄合成cDNA
利用莖環引物逆轉錄合成cDNA第一鏈。
5. 實時定量PCR
以合成的cDNA作為模板進行實時定量PCR擴增，梯度稀釋的標準同時進行實時定量PCR擴增，根據Ct值制備標準曲線。以同樣的方法測定每個樣品中U6 snRNA含量作為內參，校正上樣誤差。
6. 分析結果、提供實驗報告
分析實時定量PCR結果，根據標準曲線定量樣品中的目的microRNA。提供實驗報告，包括詳細的實驗方法，實時定量PCR實驗數據和圖表。
Signature microRNA Expression Profile of Essential Hypertension and Its Novel Link to Human Cytomegalovirus Infection. Circulation, 2011.
研究者首先采用Exiqon miRCURY LNA?芯片(v11.0)檢測13例高血壓患者和5例健康人血漿樣本的microRNA表達譜，發現27個表達差異的microRNA。隨后對第二組24例高血壓患者和22例健康人的血漿樣本，應用實時定量PCR方法對芯片篩選出的表達有變化的microRNA進行驗證（見下圖）。PCR結果和芯片結果一致。并進一步在第三組，194例高血壓患者和97例健康人的血漿樣本中應用實時定量PCR方法對挑選出的重要microRNA進行檢測。發現與健康人相比，HCMV編碼的hcmv-miR-UL112在高血壓患者的血漿中表達明顯上調。
上圖：microRNA qPCR驗證microRNA芯片數據。從microRNA芯片數據挑選了20個差異表達的microRNA，利用熒光定量PCR進行驗證，結果顯示與microRNA芯片得出的表達趨勢基本一致。紅色表示健康人樣本，綠色表示高血壓病人樣本，microRNA的表達量經過snRNA U6歸一化。
