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NGS測序技術服務 DRIP-seq |
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基因芯片技術服務 Small RNA修飾芯片 m6A單堿基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表觀轉錄組芯片 circRNA表觀轉錄組芯片 |
NGS測序技術服務 RNA m6A甲基化測序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA堿基修飾檢測 tRNA堿基修飾檢測 |
PCR技術服務 MeRIP-PCR技術服務 m6A絕對定量RT-PCR技術服務 m6A單堿基位點PCR（MazF酶切法）技術服務 |
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基因芯片技術服務 DNA甲基化芯片 DNA羥甲基化芯片 ChIP-chip |
NGS測序技術服務 DNA甲?；奏?5fc)修飾測序 DNA 5hmC 測序（化學法） DNA甲基化測序 DNA羥甲基化測序 染色質免疫共沉淀測序 |
PCR技術服務 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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蛋白相對定量 TMT標記定量技術 非標定量技術 |
蛋白修飾 TMT標記定量磷酸化 非標定量磷酸化 |
RNA/蛋白-蛋白相互作用 RNA-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
背景介紹
R -loop是由轉錄的RNA鏈與打開的雙鏈DNA其中一條鏈發生堿基互補配對，形成RNA-DNA雜合鏈，同時與未配對的另一條DNA鏈游離在外組成的三方結構 [1]。它們分布廣泛，占哺乳動物基因組的 5% [2,3]。 R-loop經常出現在基因組的啟動子CGI和轉錄終止位點，形成R-loop的結構因素包括高度的GC偏倚（GC skew，在TSS下游的非模板鏈上，G比C富集）、G四聯體、DNA缺口和DNA/RNA修飾等[4]。它們在調節基因表達、DNA 復制以及 DNA 和組蛋白修飾方面發揮著重要作用，具有重要的生物學功能。
圖1: R-loop的結構[5]
DRIP-seq與Arraystar LncRNA芯片、MeDIP-seq或者CHIP-seq聯合分析，可為揭示R-loop在表觀遺傳以及轉錄調控中的重要功能提供有價值的研究視角。
R-loop通過影響DNA甲基化調控mRNA轉錄
有研究發現，在運動神經元疾病肌萎縮側索硬化（ALS4）病人中，senataxin突變導致BAMBI（TGFβ的負調控因子）啟動子R-loop含量降低，進而促進啟動子DNA甲基化來抑制BAMBI轉錄，最終激活TGFβ信號通路，促進疾病發生發展[6]。
圖2: ALS4病人senataxin突變抑制R-loop形成進而抑制BAMBI轉錄
Antisense LncRNAs形成R-loop影響mRNA轉錄
TCF21是與一種抑癌基因，在多種癌癥中表達下調，它具有頭對頭反義lncRNA TARID（TCF21 antisense RNA inducing demethylation）。TARID在TCF21啟動子附近形成R-loop，被R-loop識別蛋白GADD45a結合，招募去甲基化酶TET1，促進DNA去甲基化來增強TCF21轉錄，影響細胞周期[7]。
圖3: Antisense lncRNA通過形成R-loop調控TCF21啟動子DNA去甲基化及轉錄[4]
R-loop高通量篩選平臺DRIP-seq
對于R-loop的篩選通常采用DRIP-seq（DNA:RNA hybrid immunoprecipitation and sequencing），該項目側重于通過NGS在基因組水平上檢測R-loops結構的分布。并且通過生物信息學分析，可以在不同的領域從中挖掘出更多有用的信息。
DRIP-seq選擇 S9.6 抗體來富集 R-loop，S9.6 抗體用于特異性免疫沉淀 DNA：片段化后的 RNA 雜交體。然后可以通過對 R-loop的 DNA 鏈進行測序來實現 R-loop分析。
參考文獻：
[1] S. Hamperl, K.A. Cimprich, The contribution of co-transcriptional RNA:DNA hybrid structures to DNA damage and genome instability, DNA Repair 19 (2014) 84–94.
[2] L.A. Sanz, et al., Prevalent, dynamic, and conserved R-Loop structures associate with specific epigenomic signatures in mammals, Mol. Cell 63 (1) (2016) 167–178.
[3] Li. Miaomiao, et al., Modifications and interactions at the R-loop, DNA Repair 96 (2020) 102958.
[4] Christof Niehrs and Brian Luke, Regulatory R-loops as facilitators of gene expression and genome stability.Nat Rev Mol Cell Biol. 2020 Mar;21(3):167-178.
[5] A.H. Youssef, et al., The balancing act of R-loop biology: The good, the bad, and the ugly, J. Biol. Chem. (2020) 295(4) 905–913.
[6] Christopher Grunseich et al. Senataxin Mutation Reveals How R-Loops Promote Transcription by Blocking DNA Methylation at Gene Promoters Mol Cell. 2018 Feb 1;69(3):426-437.e7.
[7] Khelifa Arab et al., GADD45A binds R-loops and recruits TET1 to CpG island promoters. Nat Genet. 2019 Feb;51(2):217-223.
嚴格的質控體系：設置陰性對照組和陽參，以控制文庫質量。
穩定性高：實驗操作穩定性高，減少實驗操作帶來的誤差。
靈活度高：能夠直接對有基因組信息的物種進行R-loop測序。
提供數據可視化，豐富的注釋信息與文章發表級別的圖譜
1. 基因組DNA抽提
2. 超聲片段化DNA
3. S9.6抗體免疫共沉淀
4. R-loop洗脫與cDNA第二鏈合成
5. DRIP-seq文庫構建
6. 高通量測序
7. 數據分析
8. 提供實驗報告
1.R-loop peak注釋表
2. R-loop peak 在不同基因特征上的分布。
圖：餅圖顯示了R-loop peak在每個基因特征上的數目和比例。
3. R-loop peak 在不同基因特征上的富集度
圖：R-loop peak在不同基因組特征上的數目富集度和長度富集度。紅色柱子：peaks占總peaks數目的占比, 表示實際某基因特征的peak占比；藍色柱子：基因組特征區長度占所有基因特征區長度總和的占比，這個柱子可以等同于隨機分配情況下某基因特征內的peak占比。
4.R-loop peak在Genebody上的分布
圖：R-loop peak在Genebody周圍的分布。X軸表示到TSS或TES的距離，Y軸表示peak區的數目。
