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NGS測序技術服務 DRIP-seq |
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基因芯片技術服務 Small RNA修飾芯片 m6A單堿基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表觀轉錄組芯片 circRNA表觀轉錄組芯片 |
NGS測序技術服務 RNA m6A甲基化測序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA堿基修飾檢測 tRNA堿基修飾檢測 |
PCR技術服務 MeRIP-PCR技術服務 m6A絕對定量RT-PCR技術服務 m6A單堿基位點PCR（MazF酶切法）技術服務 |
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基因芯片技術服務 DNA甲基化芯片 DNA羥甲基化芯片 ChIP-chip |
NGS測序技術服務 DNA甲?；奏?5fc)修飾測序 DNA 5hmC 測序（化學法） DNA甲基化測序 DNA羥甲基化測序 染色質免疫共沉淀測序 |
PCR技術服務 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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蛋白相對定量 TMT標記定量技術 非標定量技術 |
蛋白修飾 TMT標記定量磷酸化 非標定量磷酸化 |
RNA/蛋白-蛋白相互作用 RNA-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
作為基因組DNA的直接產物，RNA對生命活動有著至關重要的意義，是生命活動的又一執行者：1、參與蛋白質的合成；2、參與轉錄后修飾和DNA修復；3、參與基因表達調控等。對于一種特定的RNA（如，lncRNA，mRNA，circRNA，microRNA，tRF&tiRNAs等），往往具有與之對應的相互作用蛋白共同執行特定的生理功能，以lncRNA為例，近年來，lncRNAs在基因表達調控方面的重要功能越來越被人們所關注，但它們的具體功能還有待闡明。LncRNA可能通過4種作用機制參與基因調控：Decoy，作為誘餌分子，替代蛋白與DNA的相互作用；Scaffold，作為骨架分子，為蛋白復合體提供空間支撐作用；Guide，作為引導分子，介導蛋白-蛋白、蛋白DNA/RNA相互識別；Enhancer，作為增強子類似組件，促進基因表達[1] 。運用RNA親和純化技術（eg. ChIRP-MS，RAP-MS[2]），構建特定RNA相互作用蛋白譜，對闡明RNA的生理病理機制至關重要。
圖1. lncRNA作用機制模型。
參考文獻
1.Rinn, J. L. & Chang, H. Y. Genome regulation by long noncoding RNAs. Annual review of biochemistry 81, 145-166, doi:10.1146/annurev-biochem-051410-092902 (2012). [PMID: 22663078].
2.McHugh, C. A. et al. The Xist lncRNA interacts directly with SHARP to silence transcription through HDAC3. Nature 521, 232-236, doi:10.1038/nature14443 (2015). [PMID: 25915022].
根據目標RNA的尺寸大小，可采用兩種相似的技術策略：
長鏈RNA：例如，lncRNA、circRNA、mRNA等常采用RNA Antisense Purification – Mass Spectrometry策略。生物樣品在非變性條件下裂解和UV交聯，或者不裂解直接在原位進行UV交聯，隨后用biotin標記的RNA anti-sense進行雜交（Control組采用非特異anti-sense或預先用RNase處理）。
短鏈RNA：例如，micoRNA、tRF&tiRNA等通常采用RNA Affinity Purification – Mass Spectrometry策略。體外合成biotin標記的目標RNA（Control組采用scramble RNA），加入到非變性裂解的生物樣品中，孵育替換內源的RNA。
隨后，通過固定化avidin對biotin進行pull-down，得到的RBP經LC-MS/MS鑒定和定量分析，與目標RNA特異性相互作用的蛋白（A, B, C, D）在兩組間具有顯著差異，非特異相互作用蛋白（X）在兩組間比例接近1：1。據此構建目標RNA的相互作用蛋白譜。
圖2.RAP-MS技術原理和實驗流程。
案例展示1
運用ChIRP-MS技術 (和RAP-MS技術原理相同的技術，a)，Stanford大學的科研人員對Xist RNA的相互作用蛋白譜進行了研究，發現81種Xist RNA相互作用蛋白，對Xist的功能行使具有重要意義。[3]
首先，為了對ChiRP-MS方法進行驗證，作者選擇了兩種已知的snRNA，U1/U2（參與剪接體的組裝）進行驗證實驗。U1/U2具有很高的表達量，同時，剪接體的組分研究得較為清楚，另外，U1/U2在抑制未成熟mRNA的剪接和poly-A化方面的作用已見報道，預示著更多未知的相互作用蛋白可能被鑒定到，因此U1/U2很適用于ChIRP-MS方法驗證。針對U1/U2設計anti-sense RNA進行ChIRP-MS實驗，結果如下：U1和U2分別富集了418和370個蛋白，其中113個已知的剪接體蛋白（共143個）(c)。
相互作用網絡圖進一步展示了U1/U2互作蛋白富集情況：位于上部的為已知蛋白，主要為剪接體蛋白，位于下方的為功能未知蛋白，包括只與U1或U2互作的蛋白以及和兩者共同作用的蛋白。ChIRP-MS技術不僅能夠很好的鑒定已知的RNA互作蛋白，同時也能鑒定未知蛋白，是研究RNA-protein相互作用的強大工具。
案例展示2
在多種應激條件下，tRNA能夠發生特異性酶切，產生一類功能獨特的tRNA片段（tRFs），和許多生理病理過程密切相關。來自Rockefeller University的科學家通過高通量測序技術發現一類tRFs特異性高表達于高轉移性乳腺癌細胞中，并具有特定的motif，據此推測，細胞中可能存在某些與之特異性識別的蛋白質。為了鑒定這些未知的相互作用蛋白，作者運用RNA親和純化技術，用biotin標記的tRFs片段進行pull down（短鏈RNA RAP-MS技術），結合LC-MS/MS鑒定和定量分析，發現一個潛在的結合蛋白YBX1，并進行了深入研究。結果表明，YBX1蛋白能夠與腫瘤轉移相關基因mRNA結合并穩定mRNA，而tRFs可與mRNA競爭性結合YBX1，進而使腫瘤轉移相關的mRNA去穩定性，抑制腫瘤的轉移性。[4]
