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NGS測序技術服務 DRIP-seq |
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基因芯片技術服務 Small RNA修飾芯片 m6A單堿基分辨率芯片 mRNA&lncRNA表觀轉錄組芯片 circRNA表觀轉錄組芯片 |
NGS測序技術服務 RNA m6A甲基化測序（MeRIP Seq） |
LC-MS mRNA堿基修飾檢測 tRNA堿基修飾檢測 |
PCR技術服務 MeRIP-PCR技術服務 m6A絕對定量RT-PCR技術服務 m6A單堿基位點PCR（MazF酶切法）技術服務 |
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基因芯片技術服務 DNA甲基化芯片 DNA羥甲基化芯片 ChIP-chip |
NGS測序技術服務 DNA甲?；奏?5fc)修飾測序 DNA 5hmC 測序（化學法） DNA甲基化測序 DNA羥甲基化測序 染色質免疫共沉淀測序 |
PCR技術服務 MeDIP-qPCR hMeDIP-qPCR ChIP-qPCR |
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蛋白相對定量 TMT標記定量技術 非標定量技術 |
蛋白修飾 TMT標記定量磷酸化 非標定量磷酸化 |
RNA/蛋白-蛋白相互作用 RNA-蛋白相互作用 蛋白-蛋白相互作用 |
相關服務
DNA甲基化芯片 DNA羥甲基化芯片 DNA羥甲基化測序 染色質免疫共沉淀測序 MeDIP-qPCR相關產品
相關資源
DNA甲基化是表觀遺傳（Epigenetics）調控的重要組成部分，在維持正常細胞功能、遺傳印記、胚胎發育以及人類腫瘤發生中起著重要的作用，是目前新的研究熱點之一。在哺乳動物中，甲基化一般發生在CpG的胞嘧啶5位碳原子上，通過使用5’-甲基胞嘧啶抗體富集高甲基化的DNA片段，并結合Illumina高通量測序平臺，對所有富集的DNA片段進行高通量測序，研究人員能夠獲得全基因組范圍內高精度的甲基化狀態，為深入的表觀遺傳調控分析提供了更有利的切入點。
Aksomics（原康成生物）為您提供甲基化測序技術服務，您只需要提供保存完好的組織或細胞標本，Aksomics的技術服務人員就可為您完成全部實驗操作，包括超聲打斷基因組、甲基化DNA免疫共沉淀、MeDIP與 Input DNA文庫構建、高通量測序和數據分析、并提供完整的實驗報告。
DNA甲基化測序技術優勢
● 靈活度高：能夠直接對任意物種的高甲基化片段進行測序，無需已知的基因組序列信息。
● 檢測范圍廣：覆蓋整個基因組范圍的甲基化區域。
● 精確度高：能夠在實際結合位點50個堿基范圍內精確定位。
● 數字化信號：直接對甲基化片段進行測序和定量，不存在傳統芯片雜交的熒光模擬信號帶來的交叉反應和背景噪音問題。
MeDIP-seq技術服務優勢
● MeDIP富集效果特異性佳：MeDIP是獲得準確測序數據的關鍵。AksomicsMeDIP平臺經過不斷地優化，抗體富集效率高和特異性好。
*圖釋：Aksomics優化后的MeDIP平臺效果。橫坐標為MeDIP-score其數值大小代表基因啟動子甲基化水平，縱坐標為基因的數目。左圖為用經典MeDIP方法構建測序文庫的效果，陽性基因H19和Xist的信號無法和陰性基因GAPDH進行區分。右圖為優化后的結果展示，陽性基因的MeDIP-score值遠高于陰性基因，證明抗體富集的特異性。
● 嚴格的質控體系：Aksomics在MeDIP-seq每個關鍵步驟都加入了質控實驗。這些QC數據能夠評估每個步驟的質量。如果達不到標準，我們會重復實驗步驟或者優化實驗體系，使得每個樣品都能夠順利進入下個實驗環節。
*圖釋：MeDIP-qPCR質控。測序實驗之前先對MeDIP實驗效果進行評估，確定抗體富集的特異性。圖中H19的啟動子區域為陽性對照，管家基因GAPDH啟動子區域為陰性對照，檢測結果以MeDIP樣品和Input樣品的qPCR數據的比值表示?？梢钥闯觯篗eDIP特異地富集甲基化的DNA區域，且陽性信號遠高于背景噪音。
*圖釋：MeDIP-seq技術服務流程和關鍵步驟的質量控制
● 優化的文庫制備流程: 起始量少至1μg乃至更少量的起始DNA樣品即可進行甲基化測序實驗；同時，對MeDIP富集過程及測序文庫嚴格的質量監控保證了高品質的測序結果。
● 對DNA甲基化水平進行數字化定量分析：通過對測序得到的大量序列進行深入分析，MeDIP-seq得到的序列信息能夠轉換為可定量的甲基化水平信息。對基因組任意區域的甲基化水平給出定量的結果，并分析差異甲基化的區域。
● 可視化分析: 提供50bp精度的全基因組DNA甲基化信號可視化數據。通過UCSC基因組瀏覽器（UCSC genome browser），任意區域的甲基化水平能夠直觀的進行展示和比較。
1. 甲基化DNA免疫共沉淀（MeDIP）
2. 測序文庫構建
3. DNA成簇（Cluster）擴增
4. 高通量測序
5. 數據分析
6. 提供實驗報告
全基因組甲基化譜
1. 甲基化峰識別
通過MACS軟件，可以利用與基因組匹配的read來識別甲基化峰，常用的MACS篩選參數：q-value≤ 10-4 。
* mRNA相關的甲基化峰識別
* lncRNA相關的甲基化峰識別
* Small_ncRNA相關的甲基化峰識別
上表： 全基因組甲基化譜數據列表
差異甲基化區域
1. 識別差異甲基化基因
通過diffReps軟件，Aksomics對不同樣品或樣品組間的基因啟動子區域的差異甲基化進行了分析，常用的diffReps篩選參數是：log2FC≥1, p-value≤10-4 。為了對甲基化水平進行定量分析，處理組和對照組的樣品分別通過相應的input樣品進行標準化。根據處理組樣品甲基化水平相對對照組的上下調情況，這些在啟動子區域差異甲基化的基因被分成了“高甲基化”（hyper-methylation）和“去甲基化”（hypo-methylation）基因。
* mRNA相關的啟動子區域差異甲基化基因列表
* lncRNA相關的啟動子區域差異甲基化基因列表
* Small_ncRNA相關的啟動子區域差異甲基化基因列表
上表： 全基因組啟動子區域差異甲基化數據列表
2. Enhancer & Super-enhancer相關的基因間差異甲基化列表
*Enhancer 相關的基因間差異甲基化基因列表
*Super-Enhancer 相關的基因間差異甲基化基因列表
上表：增強子和超級增強子相關的基因間差異羥甲基化列表
3. 差異甲基化基因的聚類分析
聚類分析對于理解差異甲基化基因的功能、調控是十分有幫助的。具有相似甲基化模式的樣品能夠被聚類在一起，以揭示難以用傳統方法鑒定的潛在信息。
*圖釋：DMR區域聚類分析應用實例。AML病人按照血清中2-羥基戊二酸的含量分成2-HG高和2-HG正常兩組。分離病人早期造血干細胞，檢測DNA甲基化圖譜，篩選組間差異甲基化的基因進行聚類分析。聚類結果表明兩類病人呈現不同的甲基化特征。
4. 差異甲基化基因的GO分析
為了方便客戶了解啟動子差異甲基化基因的功能，Aksomics還分別提供了去甲基化基因和超甲基化基因的GO分析。
5. 差異甲基化基因的Pathway分析
可視化
Aksomics提供WIG格式的MeDIP-Seq甲基化譜數據，可以通過UCSC瀏覽器或IGB瀏覽器進行可視化。通過可視化圖，客戶可以直觀的了解具體區域或基因的甲基化情況，以及樣品間的差異甲基化狀況。
癌癥早期診斷分子標記物篩選(DNA–Methylome Analysis of Mouse Intestinal Adenoma Identifies a Tumour-Specific Signature That Is Partly Conserved in Human Colon Cancer. Plos Genet. 2013)
小鼠模型可以模擬癌癥發生的最初狀態，找到疾病早期發生的表觀遺傳變化，這些變化位點可以作為腸腺癌早期診斷的分子標志物。研究者用MeDIP-seq檢測疾病小鼠模型（APC基因缺失）的正常組織（n=3），腺癌組織(n=3)以及正常小鼠的小腸組織(n=3)樣品。測序量為每個樣品20 M reads, 平臺為illumina。 比對腺癌組織和正常組織的數據，篩選得到13，000個差異甲基化區域（DMR）。
針對MeDIP-seq的數據進行生物信息分析，發現小鼠癌組織中DNA甲基化水平升高的基因顯著地富集在PRC2靶標基因中，因此推測在癌組織中PRC2引起的組蛋白H3K27me3修飾變化和DNA甲基化之間存在互作關系。進一步通過表達譜的數據發現，DNMT3b，EZH2等表觀修飾酶在癌組織中表達量發生改變，說明了小鼠腺癌組織發生表觀遺傳修飾改變的分子機制。
同時，研究者用MeDIP-seq方法對14對人結腸癌和癌旁組織行檢測。綜合兩部分數據，找到54個保守基因在人和小鼠癌組織中呈現相同的DNA甲基化變化模式（圖4），這些基因啟動子的變化是在臨床樣本中的表現非常均一，是結腸癌中的核心表觀遺傳改變，可以作為早期診斷的候選標志物。
技術路線：
結果展示：
對小鼠組織的MeDIP-seq數據進行分析，發現腺癌組織和正常小腸相比有1，3000個區域發生甲基化水平的變化(DMR)。
圖1. A. 根據DMR在基因組的位置，分類進行統計分析。發現差異的甲基化區域主要集中在CpG島以及包含CpG島的啟動子區域。CGI: CpG島; Prom: 基因啟動子; Exon:外顯子; Exon/Prom: 外顯子和啟動子交界處; Repeat:重復序列; Intron: 內含子。 B. 應用UCSC browser可視化文件查看Ush1g基因的DMR，該區域在腺癌（Ad4, Ad4-1, Ad5, Ad6, Ad7）與正常小腸(B1, B2, B3)，癌旁組織(N4,N5,N6)相比DNA甲基化水平升高。
圖2. GSEA分析：證明腺癌中甲基化水平升高的基因(hypermethylated promoter)顯著富集在PRC2的靶標基因中，p<0.001, FDR=0。
小鼠腺癌和正常組織相比表達水平的差異基因和DNA甲基化水平的差異基因的聯合分析，用韋恩圖表示，如圖3。
圖3. A：啟動子區域DNA甲基化水平變化的基因；啟動子DNA甲基化水平降低的基因有25個表達上調，5個表達下調；啟動子DNA甲基化水平升高的基因中有14個表達下調，8個表達上調。B： Gene body的DNA甲基化水平發生變化的基因；Gene body DNA甲基化水平降低的基因中有21個表達上調，3個表達下調；Gene body DNA甲基化水平升高的基因中有11個表達下調，9個表達上調。
早期癌癥小鼠模型的MeDIP-seq數據和14例臨床樣品的MeDIP-seq數據進行聯合分析。54個保守基因在臨床樣本和小鼠模型中甲基化水平變化趨勢相同。聚類分析表明這些基因的甲基化水平能夠區分癌組織和正常組織，因此可以作為結腸癌早期診斷的標志物的候選分子。（圖4）
圖4.聚類分析
→ Pyrosequencing analysis of IRS1 methylation levels in schizophrenia with tardive dyskinesia . Molecular Medicine Reports . 2020
→ The detrimental effects of glucocorticoids exposure during pregnancy on offspring’s cardiac functions mediated by hypermethylation of bone morphogenetic protein-4 . Cell death & disease . 2018
