DNA羥甲基化芯片

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•        DNA 羥甲基化是一種重要的表觀遺傳修飾，對基因的表達起調控作用，在神經分化和癌癥中發揮重要的作用。這種新的DNA甲基化修飾形式—5羥甲基胞嘧啶修飾在哺乳動物細胞組織廣泛存在。這種羥甲基化修飾被認為是雙加氧酶家族TET通過氧化5甲基化胞嘧啶形成的。為深入了解5hmC的作用，我們就必須清楚5hmC在基因組的分布情況。然而，傳統的基于重亞硫酸鹽的方法無法區分5-hmC和5-mc。5-hmC單克隆抗體捕獲法是研究DNA羥基化修飾的利器，結合芯片技術以及生物信息分析，可以獲得全基因組羥甲基化分布圖，從而能幫助我們從一個新的角度來解析胚胎發育，神經細胞分化以及癌癥發生的分子機制。

  Aksomics（原康成生物）為您提供羥甲基化芯片技術服務，可以快速便捷地確定5hmC在ncRNA和mRNA啟動子區，以及其他一些重要的基因組區域的分布。您只需要提供保存完好的組織或細胞標本，Aksomics的芯片技術服務人員就可為您完成全部實驗操作，包括酶消化基因組DNA、5’羥甲基化DNA免疫共沉淀、hMeDIP與 Input DNA片段線性擴增、熒光標記、芯片雜交、圖像采集和數據分析、并提供完整的實驗報告。

  Arraystar 4x180K 啟動子芯片

         Arraystar啟動子芯片是專門為研究啟動子區域的甲基化、羥甲基化、組蛋白修飾以及轉錄因子結合而設計的產品，覆蓋所有RefSeq數據庫基因的啟動子區（Arraystar RefSeq Promoter Array）或是所有非編碼RNA的啟動子區（Arraystar ncRNA Promoter Array），能夠滿足不同客戶的需求。180K的芯片，啟動子的覆蓋范圍近2kb，并覆蓋了幾乎所有啟動子區附近的CpG島，是一款高品質高性價比的羥甲基化芯片產品。

  
  

  Arraystar Refseq啟動子芯片產品列表

  芯片名稱	物種	規格	覆蓋范圍
  Arraystar Human Refseq Promoter Array	Human	4x180K	23,148 RefSeq promoters (-1,300 bp ~ +500 bp of TSS)
  Arraystar Mouse Refseq Promoter Array	Mouse	4×180K	22,327 RefSeq promoters (-1,300 bp ~ +500 bp of TSS)
  Arraystar Mouse RefSeq Promoter Array	Rat	4×180K	15,987RefSeq promoters (-1,300 bp ~ +500 bp of TSS)

  
  

  Arraystar ncRNA啟動子芯片產品列表

  芯片名稱	物種	規格	覆蓋范圍
  Arraystar Human ncRNA Promoter Arrar	Human	4x180K	27,248 lncRNA promoters (-1,300 bp ~ +500 bp of TSS) + 622 miRNA promoter (-50 kb to mature miRNA)
  Arraystar Mouse ncRNA Promoter Array	Mouse	4×180K	18,552 lncRNA promoters (-1,300 bp ~ +500 bp of TSS) + 346 miRNA promoter (-50 kb to mature miRNA)

  
  

  Arraystar 癌癥相關甲基化芯片

  Arraystar Cancer Block芯片

         Arraystar Cancer Block芯片是專門為研究癌癥相關的block區域而設計的產品，覆蓋位于7088個block區域中的2554個蛋白編碼基因、8481個長鏈非編碼RNA、463個miRNA genes。通過這款芯片可以檢測block區域中的基因和LncRNA的甲基化變化，組蛋白修飾以及轉錄因子結合情況。此外，結合Arraystar Cancer Block芯片，還可以了解甲基化變化與基因表達水平間的聯系。

  芯片名稱	物種	規格	覆蓋范圍
  Arraystar Human Cancer Block Array	Human	4x180K	27MB。位于7088個block區域中的2554個蛋白編碼基因、8481個lncRNA、463個miRNA genes

         研究表明：癌癥中存在著一些低甲基化的區間（block），這些區間的長度在5kb到10M之間，長度中位值為28kb。1/3的基因轉錄起點都位于這些block中。此外，這些低甲基化的block與包括LADs*和LOCKs*在內的異染色質區域存在著很大重疊，表明癌癥中的甲基化變化與染色質結構改變之間存在著很大的關聯性。此外，低甲基化block中包含了絕大部分在腫瘤中表達變異較大的基因。而且，這些區域不僅整體甲基化水平下降，而且相對于正常樣品，它們在不同腫瘤樣品中甲基化水平變化更加劇烈。這表明：基因在癌癥中的平均表達水平和平均甲基化程度固然很重要，它們在不同樣品中的均一性也不容忽視，甚至是更加重要。

  *：LADs：與核纖層蛋白結合的DNA區域。 LOCKs（large organized chromatin lysine modifications）：富含異翻譯后修飾（例如：組蛋白H3K9二甲基化修飾）的異染色質區域。

  
  

   

  圖1. 26個位于低甲基化block區域內的高變異基因的標準表達值（log轉化后）。這些基因在腫瘤樣品（紅色點）中展現出劇烈的表達變異，而在正常樣品（藍色點）中表達變異很小。

  
  

  Arraystar Cancer DMR芯片

         Arraystar Cancer DMR芯片是專門為研究癌癥相關的差異甲基化區域而設計的產品，覆蓋12113個與癌癥、組織及細胞分化相關的small DMRs, 以及11380個與這些small DMRs相鄰的CpG島及CpG島岸。通過這款芯片不但可以檢測癌癥相關的甲基化變化，還可以了解引起這種甲基化變化的CpG島邊界漂移模式，從而更加全面直觀的解析癌癥甲基化組。

  芯片名稱	物種	規格	覆蓋范圍
  Arraystar Human Cancer DMR Array	Human	4x180K	51MB 。12113個與癌癥、組織及細胞分化相關的small DMRs, 以及11380個與這些small DMRs相鄰的CpG島及CpG島岸

         癌癥中，除了低甲基化的長區間（block），還存在著許多長度小于5kb的差異甲基化區域（DMRs），被稱為small DMRs。大部分癌癥或組織特異性的差異甲基化區域（small DMRs）都位于CpG島邊緣2kb以內；相對于CpG島，這一CpG密度較低區域稱之為CpG島岸（CpG shore）。癌癥中，CpG島邊界發生漂移，從而導致CpG島岸的甲基化水平發生變化：當CpG島邊界向CpG島內部移動時，CpG島岸發生超甲基化；當CpG島邊界向外移動時，CpG島岸發生低甲基化。CpG島邊界的變化導致了基因表達的改變（圖1）。

  
  

   

  圖1. DMR區域喪失甲基化穩定性的模式。圖中橫軸代表基因組特定區域，縱軸代表相應位點的甲基化程度，藍色的線代表正常樣品，紅線代表癌癥樣品，DMRs區域用粉紅色的背景標記。癌癥相關的甲基化變化可以分為四類主要的模式：（a）甲基化邊界外移；（b）甲基化邊界內移；（c）甲基化邊界消失；（d）通過去甲基化形成的新的DMR區域。

  
  

  
  
• ● 一站式服務：客戶只需要提供保存完好的組織或細胞標本，Aksomics的芯片技術服務人員就可為您完成全部實驗操作（圖1）和數據分析流程，并提供完整的實驗報告。
  ● hMeDIP富集效果特異性佳：hMeDIP是獲得準確測序數據的關鍵。Aksomics在表觀遺傳領域有著豐富的經驗，hMeDIP平臺經過不斷地優化，抗體富集效率高和特異性好。
  ● 嚴格的質控體系：Aksomics在hMeDIP-chip每個關鍵步驟都加入了質控實驗。這些QC數據能夠評估每個步驟的實驗質量。如果達不到標準，我們會重復實驗步驟或者優化實驗體系，使得每個樣品都能夠達到質控標準（圖1，2）。

  
  

  

  ● 豐富的生物信息學分析：除了嚴謹，可靠的實驗體系，Aksomics還有強大的生物信息學團隊，為客戶提供paper級的圖表和深入的數據分析服務
• 1.超聲打斷基因組
         將基因組DNA超聲打斷成400bp-500bpDNA片段
  2. 羥甲基化DNA免疫共沉淀
         a)  加熱變性并將變性后的單鏈DNA樣品分成兩份
         b)  其中一份單鏈DNA樣品加入抗5’-羥甲基化胞嘧啶核苷抗體
         c)  用免疫磁珠法分離b步樣品中5’羥甲基化DNA片段的抗體復合物，樣品中其余的非甲基化DNA片段被清洗掉
         d)  純化免疫共沉淀的DNA片段（hMeDIP）
         e）評估免疫共沉淀的富集效率
  3. hMeDIP與 Input DNA片段線性擴增
         使用Sigma WGA Kit對上述兩份DNA片段（hMeDIP 與 Input）進行擴增。該步驟使檢測的靈敏度得到大幅度提升，用微量的檢測樣品就能得到精確的檢測結果
  4. 熒光標記
          對hMeDIP(Cy5)與Input(Cy3)樣品分別進行標記
  5. 芯片雜交

         標記后的hMeDIP與Input樣品混合、變性，與甲基化微陣列檢測芯片雜交
  6. 圖像采集和數據分析

         用高解析度芯片掃描儀檢測雜交信號；用專業商用分析軟件對雜交結果進行數據提取、標準化、峰值分析、報告
  7. 提供實驗報告：包括詳細的實驗方法和芯片實驗數據和圖表
         ● Scanning Image：Cy3、Cy5熒光掃描圖像
         ● Raw Data：包括每個探針的熒光信號強度原始數據
         ● Probe Report：經過校正得到每個探針的log2(hMeDIP/input)值以及p-value值。
         ● log2(hMeDIP/input)值代表每個探針在hMeDIP DNA和input DNA中的相對富集強度, P-Value表示探針紅綠信號差異是由非生物因素造成的概率；P-Value越低，表示該探針越有可能代表一個甲基化事件，P-Value由修正的KS檢驗算法計算
         ● Peaks Report：Peaks代表可能的DNA羥甲基化區域，由專業商用軟件計算，報告包括可能的Peaks的染色體定位信息以及Peaks周圍的基因和CpG島的相關信息
         ● Summary Report:提供多樣本之間Peaks區域的比較以及匯總以提供參考
  8. Differential Enrichment Peaks（Advanced Analysis）
         Differential Enrichment Peaks（DEP）利用重復組中多樣本log2ratio的平均值分析組間差異甲基化區域，從而使得用重復樣本實驗數據進行甲基化結果的比較及差異甲基化區域的鑒定成為可能，這對于后續實驗及分析是非常重要的。

• Arraystar羥甲基化芯片基本數據分析展示

  1.羥甲基化峰識別和注釋:

         為了消除系統誤差和芯片間差異。分別使用中值標準化，quantile標準化和線性平滑的方法對芯片數據做標準化。標準化后的數據使用NimbleScan v2.5 (Roche-NimbleGen)識別羥甲基化峰（peaks）。將找到的羥甲基化峰根據轉錄本promoter和CpG density的信息做注釋。

         許多研究表明啟動子羥甲基化和下游基因的轉錄抑制間有密切的關聯。據報道，哺乳動物中基因啟動子的羥甲基化狀態與其GC含量有關。因此我們基于CpG ratio，GC含量和CpG豐富區長度，將啟動子分成如下三類：

         * 高CpG密度啟動子(Hgh CpG-density Promoter, HCP): 首先我們定義啟動子區為TSS上游0.7kb ~ TSS下游0.2kb。該區域內若有任意一個500bp的窗口，其G+C比例 >= 0.55，并且CpG觀測/期望比 (observed/expected, O/E) >= 0.6。

         * 低CpG密度啟動子(Low CpG-density Promoter, LCP): 啟動子不包含CpG O/E >= 0.4的500bp長的區域。

         * 中CpG密度啟動子(Intermediate CpG-density Promoter, ICP): 不屬于HCP或ICP的啟動子。

         Aksomics分別提供了不同類型的啟動子區域（HCP,ICP,LCP）的羥甲基化分析結果。下面以HCP為例，展示了羥甲基化峰注釋表格。

         EnrichmentPeaksInHCP表格：每一個樣品中對應到HCP的peaks，包括HCPs和peaks的詳細信息。

  

         SummaryEPInHCP表格：所有樣品中對應到HCP的peaks數目，表格中不包括peaks的詳細信息，用計數的方式表示某個HCP在特定樣品中的對應的peaks數目。 

  

  
  

  2.差異羥甲基化(DEP)分析

         兩組樣品進行比較，篩選差異富集峰(DEP)即差異羥甲基化區域的。我們使用每組log2-ratio的均值，并為每個探針計算M’ value。然后將結果導入NimbleScan進行peak finding，找到的peaks便是差異羥甲基化區域（DEP）。Aksomics分別提供了不同類型的啟動子區域（HCP,ICP,LCP）的差異羥甲基化分析結果。下面以HCP為例，展示了差異羥甲基化表格。適用范圍：兩個或兩組樣品間的比較。

         DEPInHCP表格：每個比較中找到對應有HCP的DEP。

  

         Control vs Expriment比較中在chr1上1235129~1235386區域的peak。該peak對應的是ACAP3基因的啟動子，這個啟動子屬于HCP類型。

  
  

         SummaryInHCP 表格：所有比較對應有HCP的DEP。表格中不包括peaks的詳細信息，用計數的方式表示某個HCP在特定比較中的DEP數目。

  

         以下表第一行為例：顯示的是Expriment vs Control比較中有一個DEP在基因AADAT的啟動子上，這個基因的啟動子屬于HCP類型啟動子。

  
  

  3.差異羥甲基化基因的GO分析

         為了方便客戶了解啟動子差異羥甲基化基因的功能，Aksomics還分別提供了差異羥甲基化基因的GO分析。

         適用范圍：兩組或多組數據比較獲得的差異羥甲基化的基因。

  

  
  

  4.差異羥甲基化基因的Pathway分析

         為了方便客戶了解啟動子差異羥甲基化基因參與的生物學過程，Aksomics還分別提供了差異羥甲基化基因的Pathway分析。

         適用范圍：兩組或多組數據比較獲得的差異羥甲基化的基因

  

  
  

  5.可視化

         Aksomics提供GFF 格式的hMeDIP-Chip羥甲基化譜數據，可以通過SignalMap軟件進行可視化。通過可視化話圖，客戶可以直觀的了解具體區域或基因的羥甲基化情況，已經樣品間的差異羥甲基化狀況。

  

  用Signal map顯示樣品間差異甲基化區域。

  圖中紅色為樣品1，藍色為樣品2.

  EP：單個樣品中羥甲基化富集的區域(Enrichment peak); 

   DEP:樣品間差異羥甲基化區域（Differentially enrichment peak）

  
  

  高級數據分析結果展示

         表達譜數據(mRNA, LncRNA, miRNA) &羥甲基化芯片數據聯合分析

         通過表達譜數據和羥甲基化芯片數據聯合分析，可以找出受甲基化調控的mRNA，LncRNA和miRNA。下面的兩個圖為mRNA表達譜數據與相應羥甲基化芯片聯合分析結果。適用范圍：同時具表達譜數據和羥甲基化譜數據的樣。

  * 聯合分析列表

  

  上圖：展示了羥甲基化芯片結果D40 vs D20羥甲基化程度增加且表達譜芯片結果D40 vs D20 表達下調2.0倍的基因

  
  

• 致癌物誘發肝癌的早期診斷分子標記物（Dynamic changes in 5-hydroxymethylation signatures underpin early and late events in drug exposed liver. John P. Thomson. Et al.Nucleic Acids Research 2013.）

         研究者應用小鼠模型來研究致癌藥物誘導肝癌過程中肝臟DNA羥甲基化和甲基化圖譜的變化。分別采用hMeDIP-chip和MeDIP-chip方法對攝入苯巴比妥鈉1天（n=5）, 7天（n=5）, 28天（n=5）和91天（n=5）以及相應對照小鼠的肝臟DNA羥甲基化和DNA甲基化進行檢測，發現DNA羥甲基化的變化要早于DNA甲基化。小鼠肝臟DNA羥甲基化在藥物攝入1天后就發生了改變，聚類分析表明這些變化位點在組內的樣品（n=5）中重復性高，證明羥甲基化的改變不是隨機的變化，非常穩定。結合表達譜的數據，研究者發現攝入藥物后DNA羥甲基化水平的改變和基因表達的變化顯著相關，其中包括藥物代謝的重要酶P450家族成員。綜合考慮基因表達的變化和羥甲基化的改變，研究者篩選到6個基因的啟動子區段的DNA羥甲基化作為癌癥早期診斷的分子標志物，其中包括和多種肝臟腫瘤相關的非編碼RNA Meg3。

  
  

  技術路線：

  

  
  

  結果展示：

  

  *圖釋：苯巴比妥攝入1天后小鼠肝臟的羥甲基化水平就發生了改變，用生物信息學算法找到啟動子（PPRs）羥甲基化水平發生變化的基因，用升高（hyper）前100，,降低(hypo)前100,以及隨機挑選的100個基因的啟動子DNA羥甲基化的變化值做熱圖。藍色為羥甲基化水平升高，紅色為羥甲基化水平下降。如圖所示，這些變化位點在組內不同個體間重復性高，證明不是隨機的變化。