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NGS測序技術服務 DNA甲?；奏?5fc)修飾測序 DNA 5hmC 測序（化學法） DNA甲基化測序 DNA羥甲基化測序 染色質免疫共沉淀測序 |
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5羥甲基化的研究背景及與疾病的關系在人類基因組中，5mC占據總胞嘧啶的比例為2-8%，并且5mC修飾在很多生物學過程中，如基因表達、基因組穩定性維持、父母印記、X染色體失活、發育調控、衰老以及癌癥的發生發展等生物學過程中發揮著不可替代的作用。5hmC作為5mC的氧化產物，主要存在于腦組織、神經細胞和胚胎干細胞中，在這些樣本中的5hmC的含量在0.3-0.7%。5hmC是通過TET氧化5mC而得到，這種氧化作用依賴于亞鐵離子和a-酮戊二酸。5hmC在胚胎干細胞的維持、正常血細胞生成以及惡性腫瘤和受精卵的發育等生物學過程中起著重要的作用，同時也在DNA的去甲基化過程中發揮著承上啟下的作用。
為了更好更深入地了解5hmC的生物學功能，需要特異性強、方法成熟的DNA 5hmC富集技術。然而，傳統的基于重亞硫酸鹽的方法無法區分5-hmC和5-mC。 康成生物丨數譜生物DNA 5hmC測序（化學法）能特異性富集DNA 5hmC片段，同時有很高的富集效率，完全滿足對DNA 5hmC特異性檢測的需要。該方法是基于beta-GT能夠特異性地將葡萄糖結合在5hmC這一原理而開展的?？党缮镓瓟底V生物DNA 5hmC測序（化學法）及數據分析，可以獲得全基因組羥甲基化分布圖，幫助研究者從一個新的角度解析胚胎發育、神經細胞分化以及疾病發生的分子機制。
Aksomics（原康成生物）為您提供一站式DNA 5hmC測序（化學法）技術服務，您只需要提供保存完好的組織或細胞標本，我司就可以為您完成從DNA提取、5hmC DNA富集、文庫構建、高通量測序到數據分析的一整套服務，并提供完整的實驗報告。
圖釋. DNA 5hmC測序（化學法）測序的流程示意圖
高度特異性: 本方法可以從DNA修飾（C，5mC，5hmC）中特異性識別5hmC
Figure 1. 分別對加入了含有3種不同修飾的spike in（分別為C、5mC和5 hmC）的DNA樣品(10 ug)進行富集試驗，富集完成后，分別針對spike-in的P1，p2，p3 不同位置進行PCR檢測，結果顯示該方法具有良好的5hmC富集特異性。
無密度偏好性: 該方法富集5hmC，不依賴于DNA的修飾水平
穩定性高：實驗操作穩定性高，減少實驗操作帶來的誤差。
靈活度高：能夠直接對有基因組信息的任意物種的進行DNA 5hmC測序
精確度高：能夠在實際結合位點50個堿基范圍內精確定位。
提供數據可視化與文章發表級別的圖譜
1. peak識別及注釋
我司使用MACS2進行peak識別，并根據Ensembl數據庫和Ehancer數據庫（EnhancerAtlas）的注釋信息，對peak進行詳細注釋。
（1）Peak分類
根據peak頂點與轉錄本的相對位置關系對peak進行分類，具體分類方法如下。
Figure1. peak分類
Table1. 各樣本peaks區域
（2）peak統計
根據以上分類，對不同區域進行統計繪制餅狀圖。
Figure2. peak統計圖（TFBS: 轉錄因子結合位點）
對peaks和fragments在TSS（轉錄起始位點）及轉錄本周圍的分布情況進行統計并繪圖。
(a)Peaks密度在TSS周圍的分布 (b) Peaks密度在轉錄本周圍的分布
(c)標準化后的reads在TSS周圍的分布 (d) 標準化后的reads在轉錄本周圍的分布
Figure3. peak分布情況
修飾密度（peaks/C）用來展示修飾區域在整個染色體上的分布情況；將修飾水平分為低（0%~30%，綠色），中（30%~70%，藍色），高（70%~100%，紅色）三類，在Circos圖中進行展示（bin=1Mbp）。
Figure4. 修飾密度在不同染色體上的分布
Figure5. 不同修飾水平peaks在染色體上的分布
2. 差異peak分析
康成生物丨數譜生物使用DiffBind進行組間或樣本間比較的差異peak分析，并根據Ensembl數據庫和Enhancer數據庫（EnhancerAtlas）進行差異peak注釋。
Table2. 差異peak區域
根據差異peak注釋到的不同區域，對區域數量進行統計繪制條形圖，并以10kb為單位對peak在染色體上的分布進行統計并繪圖。
Figure6. 差異peak統計展示 (左)：差異peak分布統計圖； (右)：差異peak染色體分布圖
通過各樣本在差異peak富集程度的系統聚類分析，可以了解各組樣本間的關系?；鹕綀D通過-log10P_value和log2Fold_Change兩個條件，對比較數據進行篩選，可以直觀地展示兩組數據之間富集差異的倍數變化及顯著性的關系。
Figure 7. 差異peak聚類圖和火山圖 （左）：聚類圖； （右）： 火山圖
3.差異peak的GO & KEGG富集分析
(1)差異peak的GO富集分析
GeneOntology (GO)是一種基因功能分類條目，有三個子條目，分別描述每個基因的分子功能（MF: Molecular function）、細胞組成（CC: Cellular component）、參與的生物學過程（BP: Biological process）。通常的GO富集分析就是利用統計學算法來找出一組差異表達基因和哪些具體功能條目聯系最大，每個GO條目都對應一個統計值P-value來表示顯著性，P-value越小表示該GO條目和輸入的差異表達基因聯系越大，即該組差異表達基因大部分具有該GO條目對應的描述功能。
Table3. GO富集分析結果
Figure 8. GO富集結果圖 (左)：各GO條目中出現的基因數；（右）MF、CC、BP前十富集條目柱狀圖
(2)差異peak的Pathway富集分析
根據KEGG database (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)中的生物學通路分類條目，來找出一組差異表達基因和哪些具體的功能條目聯系最大。每個Pathway條目都對應一個統計值P-value來表示顯著性，P-value越小表示該GO條目和輸入的差異表達基因聯系越大，即該組差異表達基因P-value越小表示該Pathway條目和輸入的差異表達基因聯系越大。
Table 4. KEGG富集分析結果
Figure 9. KEGG富集結果圖
4. Motif分析
在遺傳學中，motif是指一段短的且普遍存在的核苷酸或氨基酸序列。被認為有特定的生物學意義，比如DNA上的蛋白結合位點。當motif出現在基因外顯子區域時，其對蛋白結構具有重要作用。我司使用MEME-ChIP(v4.9.1)中的DREME方法（適合于查找短的motif）來檢測motif。將得到的motif與轉錄因子結合位點motif數據庫（JASPARCORE2018）內的motif進行比較，從而得到相關motif的更多信息。
Table 5. Motif比較結果
Figure 10. Motif結果圖 （左）：Motif結果圖；（右）左圖中序列反向互補圖
5. 比對結果可視化
我司將測序數據儲存為bedGraph文件，可以在IGV或UCSC基因組瀏覽器中查看。
Figure 11. 比對結果可視化
