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位置 > 首頁 > 服務 > 表觀基因組學 > NGS測序技術服務

染色質免疫共沉淀測序

  • 簡介
  • 優勢
  • 實驗流程
  • 結果展示
  • 客戶案例
  • SCI成果

  •        染色質免疫共沉淀技術（Chromatin Immunoprecipitation，ChIP）是研究體內蛋白質與DNA相互作用的有力工具，利用該技術不僅可以檢測體內反式因子與DNA的動態作用，還可以用來研究組蛋白的各種共價修飾以及轉錄因子與基因表達的關系。

           結合高通量的新一代測序技術（Illumina Hiseq），通過對染色質免疫共沉淀（ChIP）富集得到的DNA片斷進行大規模測序，研究人員可獲得數百萬條序列標簽，并能把所關注的蛋白的DNA結合位點精確定位到基因組上，從而獲得全基因組范圍內組蛋白各種修飾狀態、轉錄因子結合位點的高分辨率分布圖。染色質免疫共沉淀測序（ChIP-Seq）是繼ChIP-chip之后，蛋白/核酸相互作用研究領域的又一技術突破。高質量、高通量、低成本的數據產出，為表觀遺傳組學研究提供了一套全新高效的技術工具。


    染色質免疫共沉淀測序應用領域： 

           組蛋白修飾，轉錄因子，RNA polymerase II，轉錄因子等。

    上圖：染色質免疫共沉淀技術已應用于檢測組蛋白各種共價修飾、CTCF、RNA polymerase II以及各種轉錄因子等DNA結合蛋白在基因組上的精確定位，為表觀遺傳組學與基因轉錄調控機制研究提供了又一有力工具。（摘自Park P.J, 2009,Nature Reviews Genetics）


  • ● 一站式服務：客戶只需提供樣品，Aksomics的技術服務人員就可為您完成全部實驗操作，包括染色質免疫共沉淀、IP與 Input DNA文庫構建、高通量測序和數據分析、并提供完整的實驗報告。

    ● 嚴格的質控體系：Aksomics在hMeDIP-seq每個關鍵步驟都加入了 質控實驗（圖2，3）。這些QC數據能夠評估每個步驟的質量。如果達不到標準，我們會重復實驗步驟或者優化實驗體系，使得每個樣品都能夠順利進入下個實驗環節。

    ● 優化的文庫制備流程：單管式建庫，減少了由于反復純化造成的樣本損失，節省珍貴樣品。
    ● 專業的生物信息分析：強大的生物信息團隊，提供專業的生信分析和paper級的圖表。

  • 1. 染色質免疫共沉淀（ChIP）

    2. 文庫構建：
          DNA末端修復 
          將'A’ 堿基加到 DNA片段末端
          DNA片段末端加接頭（adaptors）
          PCR擴增
          凝膠電泳分離純化
    3. DNA成簇（Cluster）擴增
          DNA加到flow cell 表面
          橋式PCR（Bridge PCR）成簇擴增
    4. 高通量測序
    5. 數據分析
        A.  基本數據分析
         *原始數據讀?。≧aw Data, Total Reads）
         *有效數據獲?。–lean and Mappable Reads）
         * 確定富集區域（peak finding）

         *富集區注釋（peak annotation）

         * 富集區相關基因的GO和Pathway

         * 數據可視化
        B.高級數據分析
         ChIP-Seq&表達譜數據聯合分析
    6. 提供實驗報告  
     


  • ChIP-seq 基本數據分析展示

    1.  Reads統計

           測序后，下表中列出了測序的基本信息和測序片段計數統計，包括原始測序reads計數（pass filter reads）和基因組比對唯一位置reads（uniquely aligned reads）計數。


    Sample A
    測序類型（單端/雙端）
    單端
    reads長度
    100bp
    物種
    Homo sapiens
    基因組版本
    HG19
    Clean Reads（經過Illumina CHASTITY過濾）
    31,345,987
    比對到基因組唯一位置的Reads
    26,121,682
    *圖釋：測序基本信息和片段計數統計。Clean Reads代表經過Illumina質控的高質量reads。唯一比對reads是比對到人類參考基因組HG19基因組唯一位置的reads數。
     
    2. 富集區域(“峰”)識別
           經過對測序reads的富集分析，抗體免疫捕獲的片段情況能夠被還原，可以用reads富集峰（peak）代表TFs在DNA上的結合區域。Uniquely aligned reads的分布情況經過與MACS軟件構建的Possion模型相比較，可以鑒定出有統計學意義的顯著富集的區域（“峰”）。


    *圖釋：富集區域識別結果。


    3. 富集區域(“峰”)注釋
           富集峰使用UCSC RefSeq數據庫中與之最鄰近的基因（基因的TSS與峰中心最近）進行注釋。根據這些富集峰相對于基因的位置，我們將它們分為5類（圖2）：
           1)  啟動子峰：峰中心位于啟動子區（-2000bp ~ +2000bp）的峰;
           2)  上游峰：峰中心位于啟動子上游（-20000bp ~ -2000bp）的峰;
           3)  內含子峰：峰中心位于內含子區的峰（+2000bp ~ TTS區間內的內含子）
           4)  外顯子峰：峰中心位于外顯子區的峰（+2000bp ~ TTS區間內的外顯子）
           5)  基因間峰：不屬于以上四類的峰

    *圖釋：五種類型峰位置


     

    *圖釋：ChIP-Seq富集峰注釋


     
    *圖釋：五類峰的比例
     
    4.  TSS附近ChIP-Seq信號分布
           在研究轉錄因子時，人們經常關注于TSS周圍的峰位置和信號，因此根據所有基因TSS的位置和ChIP-Seq信號，我們繪制了TSS周圍20kb的ChIP-Seq信號分布。如圖4所示，在所有基因的TSS周圍2kb以內的峰所占比例較高。

    *圖釋：TSS周圍ChIP-Seq信號分布
     
    5. 富集峰相關基因的GO分析
           GO分析是利用GO分類信息對富集區域相關的基因功能分類或定位分析。GO分類主要分3部分: Biological Process（生物學過程），Cellular Component（細胞組分）和Molecular Function（分子功能）。

    *圖釋：富集峰相關基因的富集細胞組分，可能暗示了TF的調控功能。
     
    6.  富集峰相關基因的KEGG Pathway分析
           基于KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數據庫，富集峰相關基因的通路分析允許用戶確定這些基因在KEGG中顯著富集的生物學通路。這可能暗示了TF涉及到的通路。

    *圖釋：富集的KEGG通路。與富集峰相關的基因涉及到P53信號通路中，暗示TF可能涉及到P53信號通路的調節。
     
    7.  ChIP-Seq信號可視化（UCSC Genome Browser）
          Aksomics提供了每個樣品的WIG文件，以在UCSC Genome Browser中進行可視化（圖7）。
     
     
    *圖釋：B3GNT1基因啟動子區的ChIP-Seq信號譜（UCSC Genome Browser）。
     
    Aksomics高級數據分析展示
           ChIP-Seq &表達譜數據（mRNA，LncRNA，miRNA）聯合分析
           表達譜數據提供了lncRNA、miRNA和mRNA的表達信息，而ChIP-Seq可以獲得基因的不同組蛋白修飾或是轉錄因子結合信息，結合這兩種信息能夠研究不同組蛋白修飾或轉錄因子結合與基因表達的關系。

    *圖釋：不同表達量基因的ChIP-Seq信號。根據基因表達水平，將它們分為4類，以不同顏色表示（紅色：高表達基因；綠色：中等表達基因； 藍色：低表達基因；紫色：沉默基因）。X軸：相對于TSS的位置；Y軸：tags/5bp。Tags越多，基因表達水平高；反之，基因表達水平低，提示H3K4me3對基因表達起正調控。
     

    *圖釋：不同表達量基因的ChIP-Seq信號。黑色虛線代表基因表達水平，彩色代表不同組蛋白修飾（紅色：H3K4me1；綠色：H3K4me2； 藍色：H3K4me3）?？梢钥闯鯤3K4的不同甲基化形式與基因表達都呈正相關。




  • 小兒神經膠質瘤的組蛋白修飾和基因表達調控(Chan, Fang et al. 2013)

           重度小兒神經膠質瘤患者的組蛋白H3會發生K27M突變（H3.3K27M），導致整體H3K27me2和H3K27me3 減少。作者通過ChIP-seq比較正常神經干細胞（NSC）和小兒神經膠質瘤細胞（SF7761和SF8628）的H3K27me3修飾，分析發現NSC和SF7761分別有3912和1712個基因啟動子區域發生H3K27me3修飾。結合RNA-seq，H3K27me3修飾與基因表達呈負相關。對差異H3K27me3修飾的基因進行GO分析和pathway分析，發現很多信號通路都是與癌癥相關的。該項工作揭示了小兒神經膠質瘤的發病機制，從中可以篩選小兒神經膠質瘤的生物標志物，并為治療提供了可能的靶點。
     
    技術路線：

     
    *圖釋：神經膠質瘤細胞中癌癥相關基因H3K27me3水平發生改變。A: 神經膠質瘤細胞SF7761中H3K27me3水平和神經干細胞（NSC）相比整體較低，某些具體的位點呈升高趨勢。B： NSC和SF7761 中H3K27me3結合位點的韋恩圖。 C: 差異的基因分布在癌癥相關的信號通路中。(Chan, Fang et al. 2013)


  • → Histone demethylase KDM6A promotes somatic cell reprogramming by epigenetically regulating the PTEN and IL‐6 signal pathways . STEM CELLS . 2020

    → Multi-generational obesogenic effects of sulfomethoxazole on Caenorhabditis elegans through epigenetic regulation . Journal of Hazardous Materials . 2019

    → MyoD1 suppresses cell migration and invasion by inhibiting FUT4 transcription in human gastric cancer cells . Cancer gene therapy . 2019

    → GATA3-dependent epigenetic upregulation of CCL21 is involved in the development of neuropathic pain induced by bortezomib. . Molecular Pain . 2019

    → Targeting TRPV1 on cellular plasticity regulated by Ovol 2 and Zeb 1 in hepatocellular carcinoma . Biomedicine & Pharmacotherapy . 2019

    → Targeting TRPV1 on cellular plasticity regulated by Ovol 2 and Zeb 1 in hepatocellular carcinoma . Biomedicine & Pharmacotherapy . 2019


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